研究表明，不同材料采用超低溫冷凍法脫毒時冷凍降溫方法直接關(guān)系到成苗率，選擇合適的冷凍方法對脫毒成功與否至關(guān)重要。不同冷凍降溫方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)材料特性選擇適合的方法。目前常用的冷凍方法有：快速降溫法、慢速冷凍法、逐級冷凍法、干燥冷凍法、玻璃化冷凍法、包埋玻璃化法等。直接將預(yù)培養(yǎng)材料投入液氮罐中的快速降溫法具有操作簡單、不需要特殊設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)，但是對含水量高的愈傷組織其成活率為零，不適用該方法。自增壓液氮罐

將材料從0℃逐漸降到-100℃，使得其細(xì)胞中的含水量逐漸流出到細(xì)胞外，細(xì)胞中的含水量降到最低程度，然后再從-100℃直接投入液氮中降到-196℃，這樣可以避免水分在細(xì)胞中結(jié)冰而破壞細(xì)胞，這種慢速冷凍法可以提高成活率。一般細(xì)胞在-10℃時細(xì)胞外的介質(zhì)基本形成結(jié)晶，而細(xì)胞內(nèi)部并未結(jié)冰，這樣形成細(xì)胞內(nèi)外的蒸氣壓差，如果使細(xì)胞在不同低溫下-20，-50，-70，-100℃下各處理一段時間，使細(xì)胞內(nèi)的水溶液在蒸氣壓下向細(xì)胞外不斷擴(kuò)散，脫水后細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)逐漸發(fā)生濃縮，其冰點(diǎn)降低，再投入液氮中時就減弱低溫結(jié)冰對細(xì)胞造成的傷害，大大提高回復(fù)率和成活率，這種逐級冰凍方法在多數(shù)材料超低溫保存中獲得成功。對于含水量較高的愈傷組織，采用將材料進(jìn)行脫水預(yù)處理，然后迅速投入液氮。這樣細(xì)胞經(jīng)過脫水處理后細(xì)胞內(nèi)部含水量大大降低，原生質(zhì)的濃度大大提高，提高愈傷組織的冷凍處理后的恢復(fù)成活率。用一種保護(hù)劑PVS2[其組成為：30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)DMSO+0.4mol/L蔗糖]對材料進(jìn)行處理后再迅速投入到液氮中，細(xì)胞經(jīng)過保護(hù)劑處理后可以避免細(xì)胞胞內(nèi)外形成冰晶，而形成玻璃化狀態(tài)，這種方法成活率高，但是很容易脫水過度，影響成活率，采取與逐級冷凍法結(jié)合處理來提高恢復(fù)率。當(dāng)材料較多時，可以先采用褐藻酸鈣將材料進(jìn)行包埋，然后用高蔗糖濃度的培養(yǎng)基脫水預(yù)處理，再用干燥的硅膠進(jìn)行脫水處理，再迅速投入到液氮中。為了保證成活率，經(jīng)常結(jié)合幾種冷凍降溫方法合并使用。自增壓液氮罐